《最后的晚餐》是达·芬奇最重要的代表作之一，取材于基督教的一个重要传说。故事情节是耶稣已经得知自己被弟子犹大出卖，便与众弟子在逾越节的晚上聚餐，目的是当众揭露叛徒。当耶稣说“你们中间有一个人出卖了我”时，众弟子一阵骚动，每个人都作出了符合自己个性的反映，有的惊讶，有的困惑，有的恐惧，有的愤怒，整个场面陷于混乱之中。
在达·芬奇之前，这个题材被很多画家描绘过，然而由于画家们不善于表现人的内心世界，从人物形象上难以区别善恶，便把犹大画在餐桌的对面，使其处在被孤立的位置上，与其他弟子在空间位置上进行明显区分。达·芬奇在这一点上取得了突破，他在日常生活中对各种不同性格人物的形象进行观察，从中获得很多经验和灵感，并将其应用在自己的作品当中。由于叛变者的形象是很难画的，达·芬奇在描绘犹大的形象时，也颇费脑筋，几天未曾动笔。不懂艺术的修道院院长对达·芬奇非常恼火，以为他是有意怠工，因为当时请达·芬奇作画是按时付酬的。于是，他让总管去催达·芬奇尽快作画。
总管向达·芬奇传达了院长的意思，达·芬奇知道这并非总管的本意，便对他说，这副画 马上就要大功告成，只是犹大的模特儿不好找，实在不行，只好拿院长的头像来凑合了。从此以后，院长再也不敢来打搅达·芬奇的工作了。据说，米兰大公看到《最后的晚餐》中犹大的面孔时笑了起来：“犹大简直和修道院院长一模一样，他妨碍你的工作，你巧妙地报复了他，就让他永远留在这张画里吧。正好，他总是把钱袋抓得紧紧的，舍不得在修道院的孩子身上花一分钱，使教士们吃尽了苦头。” 可见，达·芬奇这样做并非完全出于个人的报复，而是发现院长和犹大在贪财这一点上是一致的。
扩展阅读：世界上最早的绘画
远古时代，人们为了记录与大自然斗争的场面，或者为了祭祀或装饰之用，在岩壁和洞穴内刻画出简单的人兽图案，这就是最原始的壁画，也可以说是世界上最古老的绘画。目前已知最古老的绘画位于法国肖维岩洞，有些专家认为它甚至可以追溯到32000年前，这些壁画绘有马、犀牛、狮子、水牛、猛犸象等动物，以及猎人的图案。中国绘画的历史最早可追溯到新石器时代的彩陶纹饰和岩画。原始绘画技巧虽然尚显稚嫩，但原始人已经掌握了初步的造型能力，对动物、植物等动静形态也能把握其主要特征。